본 post는 국가생명연구자원정보센터(KOBIC) 주관 광주과학기술원(GIST) 박지환 교수님의 단일세포 분석 기술 소개를 정리한 내용입니다.
Intro
Single cell analysis의 다양한 기술을 자세히 알아봅니다.
RNA in Mammalian Cell
https://www.edwith.org/single-cell/joinLectures/361836
Mammalian cell에 존재하는 10~30pg의 RNA 중 protein coding mRNA는 0.25~0.9pg밖에 존재하지 않습니다. 이를 분자수로 환산하면 약 36만 개 정도입니다.
Evolution of scRNAseq Techniques
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2009년 경 수작업으로 single cell analysis 시도가 시작되었습니다. 이후 Fluidigm, drop-seq 등의 기술 발전을 거쳐 최근에는 SPLiT, sci-seq 방법들을 사용하여 동시에 수 십 만개의 single cell을 분석할 수 있는 방법이 개발되었습니다.
Single Cell Isolation Techniques
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Pipette로 dialution하며 isolation 하던 방법부터 LCM까지 발전을 거듭해 왔습니다. 현재는 Microfluidics를 이용한 isolation과 CTC(Circulate Tumor Cell)와 같이 미량의 cell을 분리하기 위해 antibody와 magnetic particle을 사용하는 방법을 사용합니다.
Full Length vs 3’ end cDNA seq
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3’ end cDNA seq의 경우 gene exporession quantification만 가능한 반면 full length cDNA seq은 alternative splicing, somatic mutation, 그리고 eQTL analysis까지 가능한 장점을 가지고 있습니다.
Droplet Technique - 10x Genomics
Droplet single cell analysis 방식으로 대표되는 10x Genomics사의 원리에 대해 알아봅니다.
10x Genomics Technique
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Lane당 약 10,000개의 cell을 분석할 수 있으며, 총 8개 lane이 있으므로 한 번에 80,000개까지 가능합니다. 하나의 oil droplet 안에는 한 개의 gel bead와 한 개의 cell이 들어있으며 cDNA 합성 과정을 거쳐 single cell analysis에 사용됩니다.
10x Genomics Technique
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Cell membrane이 lysis된 후 bead에 붙은 약 70만 개의 oligo와 함께 cDNA 합성이 진행됩니다. 이 때 Poly-A 부분이 poly(dT)에 binding하고 이후 UMI, 10x barcode가 차례로 상보적 sequence가 합성됩니다.
10x Genomics Technique
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Barcode processing부터 기본분석 완료 후 expression analysis를 진행합니다. 이 때 ‘seurat’ 프로그램을 사용하여 QC, normalization, PCA, tSNE, clustering 분석을 차례대로 진행합니다.
Take Home Message
Single cell analysis와 연관된 다양한 기술을 알아볼 수 있었습니다.