Transcriptome I - Introduction to Transcriptome

본 post는 국가생명연구자원정보센터(KOBIC) 주관 이화여자대학교 생명과학과 이상혁 교수님의 전사체 데이터 분석를 정리한 내용입니다.

Intro

RNA-seq과 microarray에 대한 전반적인 내용을 알아봅니다.

전사체 연구란?

Omics: 어떤 대상을 모두 모아서 연구하는 학문
Transcriptome 연구: 다양한 상황에서 RNA 전체를 대상으로 하는 연구
유전자 활동: 유전자 발현의 결과물(RNA, Protein 등)로 판단

유전자 발현

where?
- tissue or organ profile. 장소에 따라 어떤 gene이 발현되느냐가 달라집니다.
Under certain circumstances?
- temporal progress. 동일한 organ 내에서라도 시간에 따라 normal cell이 cancer cell로 변하면서 발현되는 gene의 종류와 양도 달라집니다.
Gene expression and Gene regulation
- a “proxy” measure for transcription/translation events! RNA/protein의 발현 정도로 발현/조절을 파악할 수 있습니다.

Omics 연구의 장점

survey of all components
- efficient for “biomarker discovery”
- unbiased view! “system biology”

Transcriptome 연구를 통해 해결할 수 있는 문제들

compare two (or more) conditions to identify differentially expressed genes
- control vs. treatment
- disease vs. normal
exploratory analysis
- what genes are expressed in response to drought stress?
- what gene expression changes occur during normal retinal development?
diagnostic & prognostic tool development
- can we predict certain conditions (breast cancer vs. normal) 암 진단법을 만들 수 있습니다.
- can we identify patterns of gene expression that predict a patient’s response to treatment/drug? 치료 예후예측

사람의 몸에 침입한 antigen은 antigen-presenting cell에 의하여 우리 몸이 침입을 감지하고 대응할 수 있도록 알리는 역할을 합니다. Cytotoxic T-cell이 직접 antigen을 공격하는 동시에 helper T-cell이 B-cell로 하여금 antibody를 생성, 배출하도록 리드합니다. 또한 memory T-cell로 하여금 적응면역을 갖도록 합니다.

Applications of Gene Expression

clustering
gene function inference
- regulatory network
molecular pathology
- classification
- diagnosis and prognosis

Transcriptome 연구 범위

exporession profiling
- mRNA, miRNA, IncRNA, …
- alternative splicing
differentially expressed genes (DEGs)
gene set and pathway analysis
precision medicine
- fusion gene analysis
- patient stratification
- cell type and composition inference

Transcriptome 연구 방법

microarray: universal biochemistry platforms
microarray
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678
- micro(작은) + array(행렬): 2d 배열의 작은 hole에 물질을 넣고 분석할 수 있는 방식
- motivations: hundreds, thousands or even millions of individual experiments are conducted in parallel, with very few reagents. 즉, 동시에 20,000개~30,000개의 gene의 발현을 한 번에 알 수 있다는 점에서 효율적입니다.
- many different types
  - DNA
  - mRNA in cDNA
  - proteins (antbodies)
  - chemical compounds
  - tissues
  - carbohydrates
- principles
  - extension of southern and northern blotting
  - microarray는 gene에 specific한 sequence로 구성된 fixed probes가 hole마다 고정되어 있습니다. (hybridization-bases)
  - normal vs. tumor의 mRNA를 각각 green, red dye를 붙인 뒤 1:1 비율로 microarray에 loading하면 normal vs. tumor에서 더 많이 발현되는 색상이 우세하게 나타납니다.
    microarray principles
    https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678
- Affymetrix expression arrays
  - Affymetrix사에서 만든 expression arrays로, 25-mers 길이의 oligo로 구성되었습니다.
  - Human Transcriptome Array 2.0은 285,000개 이상의 RNA 서열을 대상으로 발현양을 확인할 수 있습니다.
    Affymetrix Expression Arrays
    https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678
RNA-Seq (Transcriptome Sequencing)
- the high throughput sequencing of cDNA using NGS technology
- the goal is to identify regions in the genome that are being transcribed in a sample
- strategies for reconstructing transcripts from RNA-Seq
  - align-then-assemble: human reference genome에 align 한 뒤 gene별로 얼마나 붙는지 확인합니다. Quantification
  - assemble-then-align: sequencing reads끼리 assembly 한 뒤 reference genome에 align 합니다. Novel RNAs를 확인할 수 있습니다.
    RNA-Seq
    https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678
- common analysis of RNA-Seq
  - gene expression analysis
  - differential expression analysis
  - transcript discovery and annotation
    - novel transcripts/genes
    - noncoding RNAs: miRNAs, IncRNAs, …
  - gene fusion detection (structural variants)
  - alternative splicing event
  - RNA-specific phenomena
    - allele-specific expression: 부/모 어느 쪽에서 온 allele이 발현되는지 확인합니다.
    - RNA editing
  - Mutation discovery & prioritization
- advantages of RNA-Seq over microarray
  - one sample reparation, various analysis
  - RNA-Seq has higher resolution
    - single-base pair resolution
    - dynamic range of gene expression
  - variatin of RNA-Seq
    - single cell sequencing
    - miRNA sequencing
    - Long read sequencing
- challenges of RNA-Seq
  - RNA is fragile compared to DNA (easily degraded) 샘플 변성이 매우 잘 일어납니다.
  - Sample!!! purifu? quantity? quality?
  - RNAs consist of small exons separated by introns
  - the relative abundance of RNAs vary wildly
  - RNAs come in a wide range of sizes
- RNA-Seq library enrichment strategies
  - total RNA: all types RNAs가 sequencing 됩니다.
  - rRNA reduction: rRNAs를 제거한 나머지 RNAs만 sequencing 합니다.
  - PolyA selection: mRNA만 선별적으로 sequencing 합니다.
  - cDNA capture: interesting genes의 mRNA만 선택하여 sequencing 합니다.
    RNA-Seq library enrichment strategies
    https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678
- stranded vs. unstranded
  - 최근에는 대부분 stranded sequencing을 진행합니다.
    stranded vs. unstranded
    https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678
- RNA quality control
  - RIN: RNA integrity number. 0(bad) ~ 10(good). RNA quality를 나타내는 수치입니다.
    RIN
    https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678
- replicates
  - biological replicate: multiple isolations of cells showing the same phenotype, stage of other experimental condition. 즉, 시료의 양이 충분하다면 가급적 3개 이상으로 시료를 나누어 sequencing, analysis 하는 것을 권장합니다. 3개 중 1개 데이터에 이상이 있더라도 나머지 2개 데이터를 통계처리하여 올바른 결과를 도출할 수 있기 때문입니다.

Take Home Message

microarray 대비 RNA-Seq이 가지는 장점을 확인할 수 있었습니다. RNA-Seq에서 샘플의 quality가 매우 중요하고, 얻은 data로부터 gene expression level, gene fusion analysis, mutation discovery 등 다양한 결과를 얻을 수 있음을 확인 했습니다.