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Transcriptome III - Differential Expression & Visual Exploration

Posted 2022-11-22 Updated 2022-11-24 15 min read

본 post는 국가생명연구자원정보센터(KOBIC) 주관 이화여자대학교 생명과학과 이상혁 교수님의 전사체 데이터 분석를 정리한 내용입니다.

Intro

RNA-seq data의 differential exporession, visual exploration에 대해 알아봅니다.

Differential Expression

Post-Image Typical Process of Transcriptome Analysis
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • 전형적인 RNA-Seq analysis 과정은 다음과 같습니다. 지난 시간 data preprocessing 및 normalization, quantification까지 알아봤습니다. 이번 차시에서는 differential expression을 알아봅니다. 다음 차시에 순차적으로 classification, clustering에 대해 알아봅니다.

Post-Image Visual Comparison of Two data sets - Scatter plot
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • 두 개의 data sets를 비교하는데 visualization은 중요합니다. Scatter plot을 그려보면 data integrity, outlieres 등을 파악하는데 도움이 됩니다.
  • Gene expression range는 gene별로 큰 차이가 나기때문에(매우 작은 양부터 매우 큰 양까지) log scale에서 비교하면 보기가 좋습니다.

Post-Image Visual Comparison of Two data sets - MA plot
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • MA plot으로도 두 개의 data set을 비교해서 볼 수 있습니다.
  • x axis는 average express 값을 의미합니다. 즉, 오른쪽으로 갈수록 많이 expression 된다고 해석할 수 있습니다.
  • y axis는 fold-change 값을 의미합니다. 즉, 위로 올라갈수록 E1이 E2에 비해 많이 expression 된다고 해석할 수 있습니다.

Differential Expression

  • Differentially Expressed Genes(DEGs)는 다양한 조건에서 gene expression이 증가 혹은 감소하는 양상을 확인하는 방법입니다.
    • normal vs. tumor
    • treated vs. untreated
    • time series profiles

Post-Image Fold change does not take variation into account
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • 그림에서 두 개 genes에 대해 평균은 각각 같지만 expression 분포가 세 가지 유형으로 나뉘는 것을 확인할 수 있습니다.
    • low variability: variable이 작고 두 개 genes 사이 express에 명확한 차이가 있음을 확인할 수 있습니다.
    • high variability: variable이 크고 두 개 genes 사이 express에 거의 차이가 없음을 확인할 수 있습니다.

Post-Image Hypothesis Testing and p-value
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • Normal과 tumor 사이 mean 값의 차이가 있는지 없는지 확인하기 위해 hypothesis testing을 진행합니다. 두 mead 값의 차이가 없다는 null hypothesis를 세우고 p-value(오른쪽 그래프의 녹색 면적)를 계산합니다. p-value가 기준(normally 0.05)보다 낮을 때 우연한 결과가 아니라고 추정할 수 있고 null hypothesis를 기각하여 두 mean 값에 차이가 있다고 결론내릴 수 있습니다.

Post-Image t-test
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • t-test는 두 개 그룹의 mean 값에 차이가 없다는 hypothesis를 test하는 방식입니다. $\frac{signal}{noise}$ 두 개 그룹 mean 값의 차이(signal)를 두 개 그룹 분포의 크기의 차이(noise, standard error)로 나눠준 값으로 계산합니다.
  • 그룹이 세 개 이상일 때 t-test는 ANOVA로 변경됩니다.

Post-Image Volcano plot
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • p-value와 fold-change를 동시에 표현한 plot입니다.
  • x축의 fold-change는 -1 미만과 1 이상이 두 배 이상 차이나는 gene으로 볼 수 있습니다.

  • y축의 p-value는 2 이상일 때 $10^{-2} = 0.01$이하, 곧 유의미하게 차이나는 gene으로 볼 수 있습니다.

  • Multiple comparison test problem
    • 생물학에서 비교반복실험은 흔히 있습니다.
    • p-value 0.05 이하라는 의미는, 두 개 그룹간 차이가 존재할 확률이 95%라는 의미인 동시에 우연히 차이나는 것처럼 보일 확률이 5%라는 의미입니다.
    • 예를 들어 10,000개의 gene 대상으로 p-value 5% 기준으로 잡으면 500개 gene이 우연하게 선정될 수 있습니다. (잘못된 결과)
    • 10,000번의 t-test p-value 5% 기준으로 1,000개의 gene이 선택됐을 때, 결국 500/1,000 선택된 gene의 50%가 잘못된 결과로 볼 수 있습니다. (very high false discovery rate)
    • 여러 번 비교반복실험을 진행할 때 단일 테스트의 p-value 5% 기준을 그대로 사용하면 이러한 문제가 발생할 수 있으므로, 따라서 multiple comparison을 위한 p-value의 보정이 필요합니다.
  • Boneferroni correction
    • p-value를 p-value/test counts로 보정합니다.
    • 예를 들어, 1,000번의 test를 진행하면 p-value 0.05는 0.05/1,000 = 0.00005로 기준으 삼는 것입니다.
    • 그러나 이 방법은 too conservative하여 많이 사용하지는 않습니다.
  • False discovery rate(FDR)
    • $\frac{#false positives}{#called significant}$
    • Benjamini-Hochberg procedure
      • 반복실험의 p-value들을 오름차순으로 정렬합니다.
      • Bonferroni correction의 corrected p-value(p-value/test counts)를 2배, 3개, 4배, … , k배로 늘려가면서 기준을 만족하는 k값을 찾습니다.
      • FDR approach를 통해 찾은 adjusted p-value를 q-value라고 합니다.
      • 즉, q-value 5%는 significant tests 중 false positive로 확인된 비율이 5%임을 의미합니다.
  • Statistical testing for differential expression
    • 생물학 실험할 때 반드시 세 번 이상 반복실험 하는 것이 좋습니다.
    • Normalization은 샘플간 expression 비교할 때 필수입니다.
    • 분포 모델은 negative binomial distribution 사용하는 것이 바람직 합니다.
    • multiple testion problems를 해결하기 위한 correction 과정은 필수입니다.

Sample Validation

  • 다양한 이유로 sample이 서로 뒤바뀌는 경우가 발생할 수 있습니다. 이를 확인할 수 있는 다양한 방법이 있습니다.
  • Paired sample shcek
    • SNP concordance에 기반한 paired sample check 방법입니다.
    • tool: NGSCheckMate, BAMixChecker
  • Gender check
    • X/Y chromosome 상에서 read depth나 allele frequency에 기반한 gender check 방법입니다.
    • tool: SEXCMD
  • Ethnicity inference
    • 인종별로 나타나는 allele에 기반하여 ethnicity를 추정하는 방법으로 WGS or WES data를 대상으로 사용 가능합니다.
    • tool: SeqSQC, EthSEQ, LASER 2.0

Mapping

Post-Image RNA-Seq Mapping
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • 다양한 mapping 방법이 있습니다. 최근에는 genome에 mapping하는 방법이 주로 사용됩니다.

Post-Image Strategies for gapped alignments
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • RNA-Seq data를 genome에 mapping하는 방식은 크게 두 가지로 나눠 생각할 수 있습니다.
    • Exon-first approach
      • 이미 알려진 exon sequence에 read를 mapping하는 방식입니다.
      • tool: MapSplice, SpliceMap, TopHat
      • 하지만 gene과 pseudogene을 구분하지 못하고 모두 mapping 한다는 단점이 있습니다.
    • Seed-extend methods
      • N-mer의 seed reads가 어디에 matching 되는지 확인 후 확장시켜 나가는 방식입니다.
      • tool: GSNAP, QPALMA

Post-Image Tophat: Spliced Read Mapper
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • Tophat - spliced read mapper
    • Exon 내 mapping되는 reads를 먼저 선별합니다.
    • 두 개의 exon에 걸쳐있는 reads는 각각 exon 영역에 맞는 영역으로 나눕니다. 이 때 canonical intron이 지니고 있는 특징적인 서열(intron의 시작과 끝 서열: GT-AG, GC-AG, AT-AC)을 활용합니다.

Post-Image STAR: spliced transcripts alignment to a reference
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • STAR - spliced transcripts alignment to a reference
    • step1. seed searching
      • Suffiix array 알고리즘을 사용하여 MMP(Maximal Mappable Prefix)를 찾습니다.
      • N-mer의 seed reads가 mapping되면 extend하면서 read를 연장합니다.
    • setp2. clustering/stiching/scoring step
      • clustering: seed reads를 모아 cluster를 만듭니다.
      • stitching: frugal dynamic programming altorithm을 사용하여 각 pair of seeds를 연결합니다. 이 때 두 개 이상의 window를 사용하는데 scoring하여 가장 적합한 position을 찾습니다.
  • TopHat vs STAR
    • TCGA RNA-Seq AML data를 사용하여 비교한 결과입니다.
    • 동일한 data의 mapping에 TopHat2는 480분, STAR는 27분 소요됐습니다. STAR가 월등히 빠른 것을 알 수 있습니다.
    • 하지만 정확도는 TopHat2가 약간 더 앞선 결과를 보였습니다.
    • STAR를 사용하는 것이 더 효율적인 방법임을 생각해 볼 수 있습니다.

Post-Image SAM/BAM
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  • Alignment Data Format (SAM/BAM)
    • mapping 결과로 나오는 output 파일입니다.
    • 6th column의 CIGAR string은 mapping 결과를 요약해서 보여주는데, RNA-Seq data에서 N은 intron 영역을 의미합니다.
    • 예) 5M14N8M: exon 5bp + intron 14bp + exon 8bp

Normalization

  • Normalization이 필요한 이유는, raw data가 mRNA의 concentration이 아닐 수 있기 때문입니다. 다양한 이유가 존재합니다.
    • Sample preparation과 관련된 이슈가 있습니다.
      • tissue contamination
      • RNA degradation
      • amplification efficiency
      • reverse transcription efficiency
    • microarrays와 관련된 이슈가 잇습니다.
      • hybridization efficiency and specificity
      • image segmentation
      • signal quantificaion
      • ‘background’ correction
    • RNA-Seq과 관련된 이슈가 있습니다.
      • uneven depth of coverage
      • uncertainties in mapping and quantification

Post-Image Normalization
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • Normalization은 데이터의 분포와 scale을 조정하여 데이터간 비교 가능하도록 만드는 과정입니다.

Post-Image Normalization for microarray data
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  • Microarray data의 normalization은 여러 가지 방법이 존재합니다.
  • 오른쪽 아래 그림을 보면 실제 duplicate였던 색상별 reads가 normalization 이후 동일한 수준으로 변경되었음을 확인할 수 있습니다.

Post-Image Normalization for RNA-Seq data
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  • RNA-Seq data를 normalization 할 때 두 가지 사항을 고려해야 합니다.
    • 1-2: Sequencing depth가 높을수록(2) mapped reads도 증가합니다.
    • 3-4: transcript length가 길수록(4) mapped reads도 증가합니다.

  • 따라서 sequencing depth, transcript length에 대해 normalization이 필요합니다.

  • RPKM
    • Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads
    • reads 백만개 당 kilobase transcript에 mapping된 reads 수를 의미합니다.
    • normalization order: depth first -> then length
  • FPKM
    • Fragments Per Kilobase …
    • Paired-end sequencing을 했을 때 하나의 fragment에 대해 forward, reverse 두 번을 sequencing 하는데, 이를 한 개로 간주하고 계산한 결과입니다.
  • TPM
    • Transcripts Per Million
    • normalization order: length first -> then depth
    • TPM values can be compared between different samples directly because the sum of all TPMs in each sample art the same
    • 지금은 TPM이 정석처럼 사용되고 있습니다.

Quanltification

Post-Image Read Counting Rules
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  • gene 하나의 uniquely mapping되는 read가 있지만 복수 개의 genes에 걸쳐서 mapping되는 경우도 있습니다.
  • 다음과 같은 방법으로 이러한 문제를 처리합니다.
    • Estimating using unique reads (old)
      • Uniquely mapped reads만 사용하는 방식입니다.
      • 상대적으로 많은 reads를 버려야하는 단점이 잇습니다.
      • tool: NEUMA
    • Maximum Likelihood Estimation (MLE)
      • low level expression은 정확하게 측정되지 않는 단점이 있습니다.
      • tool: EMSAR, MISO, Cufflinks
    • Expectation-Maximization
      • 현재 가장 많이 사용하는 방식입니다.
      • tool: RSEM, eXpress

RNA-Seq Analysis Pipeline

Post-Image STAR-RSEM Anlysis Pipeline
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

  • Sickle / STAR / RSEM 을 사용한 RNA-Seq analysis pipeline 입니다.
    • Trimming: Sickle
    • Mapping STAR v2.6.0c
    • Quantification: RSEM v1.3.0
    • Differential expression analysis: R v3.6.0 (package: edgeR, preprocessCore, gplots, RColorbrewer)
    • Fusion analysis: STARfusion v1.6.0

Post-Image STAR-RSEM Anlysis Pipeline: trimming
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

Post-Image STAR-RSEM Anlysis Pipeline: preparing reference
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

Post-Image STAR-RSEM Anlysis Pipeline: mapping & quantification
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

Post-Image STAR-RSEM Anlysis Pipeline: mapping & quantification
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678

Post-Image STAR-RSEM Anlysis Pipeline: mapping & quantification
https://www.edwith.org/transcriptome/lecture/1382678


Take Home Message

RNA-Seq data preprocessing 과정에 대해 배울 수 있었습니다. STAR-RSEM pipeline이 가장 많이 사용되고 있음을 알 수 있었습니다.

Bioinformatics, NGS
BI bioinformatics transcriptome
This post is licensed under CC BY 4.0 by the author.
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