Experimental Design for Single Cell Analysis
본 post는 국가생명연구자원정보센터(KOBIC) 주관 광주과학기술원(GIST) 박지환 교수님의 단일세포 분석 소개 및 실험 디자인을 정리한 내용입니다.
Intro
Single cell analysis의 필요성 및 연구배경, 실험 디자인에 대한 내용을 이해합니다.
Single Cell Analysis 필요성
https://www.edwith.org/single-cell/joinLectures/361836
과거에는 RT-PCR, bulk RNA-seq 등으로 cell에서 gene expression level을 확인했습니다. 그 결과 structure, location, function, a small number of markers 등에 따라 사람은 약 200여 개 종류의 서로 다른 cell types이 존재한다고 알려졌습니다. 하지만 single cell analysis를 통해서 동일한 organ이라도 서로 다른 cell type이 존재함을 확인했습니다. 또한 한 사람당 약 20,000개의 cell과 그 곳에 포함된 약 20,000~30,000개의 gene에 대해 분석하고 더 정확한 결과를 얻을 수 있게 되었습니다.
Single Cell Analysis 필요성
Single Cell Analysis 필요성
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RNA-seq은 cell을 구분하지 못하고 평균적인 gene expression level을 확인합니다.
반면 single cell analysis는 cell별로 gene exporession level을 구분하여 확인할 수 있습니다.
Single Cell Analysis 필요성
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또한 single cell analysis를 활용하면 cell specific change와 cell type composition change를 구분할 수 있습니다. 예를 들어 정상인과 환자의 single cell analysis를 진행하면 disease와 연관된 red cell의 green gene expression high level이 cell 내 exporession 증가에 의해서인지(cell specific change), 혹은 red cell의 증가에 의해서인지(cell type coposition change) 구분할 수 있습니다.
Single Cell Analysis 필요성
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뿐만 아니라 cell이 분화하면서 변화하는 gene expression level을 추적 관찰할 수도 있습니다. 더 나아가 생물의 진화 양상을 추적할 수도 있습니다.
Basic Steps of Single Cell Analysis
Single Cell Analysis 기본 단계
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Single cell analysis의 기본적인 단계입니다. Tissue에서 cell을 분리한 다음 library를 만들고 rna seq을 진행합니다. Gene expression data를 clustering한 뒤 발현양을 비교합니다.
Single Cell Analysis: Library Preparation
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Library prep에 사용할 수 있는 방법은 여러 가지 개발되어 있으며 상요화 된 기술도 존재합니다. UMI 사용여부, cDNA를 얼만큼 cover하는지, 그리고 한 번에 몇 개의 cell을 cover할 수 있는지 등에 차이가 있습니다.
Experimental Design for Single Cell Analysis
기본적으로 모든 tissue에 대해 single cell analysis를 진행할 수 있습니다. 하지만 tissue 종류에 따라 dissociation 난이도가 다르고 포함하고 있는 total RNA 양도 다르기 때문에, 특성을 고려한 실험 디자인이 필요합니다.
Sample Preparation Protocol Varies by Cell-types
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RNA 양이 적은 solid tissue나 adherent cell culture는 dissociation을 수행합니다. 관심있는 cell만 골라낼 필요가 있는 경우에는 MACS나 FAC sorting으로 enrichment를 수행합니다.
Doublets Problems
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Single cell analysis의 문제점 중 하나는 바로 doublets입니다. Droplet 방식을 사용하는 single cell anlaysis는 필연적으로 doublelets 문제를 나타내는 것으로 알려져 있는데, cell loading 개수에 따라 그 비율이 증가한다고 알려져 있습니다.
Sequencing Depth for scRNAseq
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Single call analysis에 적당한 sequencing depth를 찾기 위한 data입니다. 약 30,000~50,000x에서 적당한 genes 개수와 umi 수를 확인할 수 있습니다. 물론 적당한 depth 또한 tissue types에 따라 달라질 수 있음을 고려해야 합니다.
또한 흥미로운 사실은 86,503x data에서 확인된 네 개의 cell clustering 결과가 25,000x, 5,000x, 500x로 줄였을 때 변함없이 네 개의 cluster가 나타남을 봤을 때 depth가 cell clustering에는 별다른 영향을 주지 않음을 확인할 수 있습니다.
Chanllenges and Future Direction for scRNAseq
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The sparsity of data
Transcript가 적으므로 data signal보다는 noise가 더 많이 나타나는 문제가 있습니다. 따라서 발현량이 0인 gene을 다수 나타납니다. 이는 RNA capture 효율과 cDNA conversion의 문제로 나타난 결과입니다.
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Batch effect
실험자, 어떤 연구실에서 실험했는지, 혹은 어떤 실험조건으로 진행했는지 등에 따라서 batch effect가 발생할 수 있습니다. 이는 computational method나 서로 다른 샘플을 multiplexing하여 해결할 수 있습니다.
Integration of Single Cell Multi-omics Data
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미래에는 single cell isolation 이후 genomics부터 metabolomics까지 다양한 multi-omics data를 분석하고 활용할 수 있을 것입니다.
Take Home Message
Single cell analysis의 원리와 활용 가능성에 대해 알아볼 수 있었습니다. 현재 업무에서 사용중인 genomics data와 disease, treatment와 연관된 database들이 scRNAseq 결과와 결합한다면 personalized medicine에 활용될 수 있음을 엿볼 수 있었습니다.